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測定意義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，線粒體中MDH是TCA循環的關鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產物， 連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH在細胞多種生理活動中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統、活性氧代謝和抗病性等。根據不同的輔酶特異性，MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH，細菌中通常只含有NAD-MDH，在真核細胞中，NAD-MDH分布于細胞質和線粒體中。

測定原理：

NAD-MDH催化NADH還原草酰乙酸生成蘋果酸，導致340nm處光吸收下降。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

ADH測定操作：

1. 分光光度計預熱30 min，調節波長到340 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑三在25℃水浴中保溫30 min。

3. 在1mL石英比色皿中依次加入100μL樣本上清液、800μL試劑三和100μL試劑四，迅速混勻后于340nm測定吸光值變化，分別記錄15s和75s時吸光值，分別記為A1和A2。△A測定管=A1-A2。

測定步驟：

1、分光光度計預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2、將試劑二在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。

3、操作表：

將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中，混勻后立即在340 nm波長下記錄初始吸光度A1和反應1min后的吸光度A2，計算ΔA=A1-A2。

注意：若A1-A2大于0.5，需將樣本用提取液稀釋，使A1-A2小于0.5，可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應稀釋倍數。

NAD-MDH活力單位的計算：

1、血清（漿）NAD-MDH活力的計算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=6430×ΔA

2、組織、細菌或細胞中NAD-MDH活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W× V樣÷V樣總）÷T =6430×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（2000×V樣÷V樣總）÷T=3.215×ΔA

V反總：反應體系總體積，8×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，1 min；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；2000：細胞或細菌總數，2000萬。

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